HAX-1 geni susturulan hücrelerde influenza virüsü replikasyonunun araştırılması

---

Tezin Türü: Yüksek Lisans

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Marmara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyokimya Anabilim Dalı, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2016

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: HASAN UĞURLU

Danışman: Kadir Turan

Özet:

Hax-1 Geni Susturulan Hücrelerde İnfluenza Virüsü Replikasyonunun Araştırılması 1. Amaç: Bu tez çalışmasında Hax1 proteinin insan tipi influenza A/WSN/H1N1 ve kuş tipi inluenza A/Duck/Pen/H5N2 virüslerinin replikasyonları etkilerin moleküler düzeyde belirlenmesi amaçlandı. Bu amaç doğrultusunda HEK293 ve HeLa hücrelerinde Hax1 geni transkript düzeyi RNAi teknolojileri ile baskılanadı ve bu hücrelerde virüs çoğalması Western melezleme ve immunfloresan teknikler ile araştırıldı. Yöntem: Memeli hücrelerinde Hax1 transkript düzeyinin düşürülmesinde iki farklı yol izlendi. Birincisi, bu gene özgü shRNA kodlayan plamit vektörler oluşturuldu ve bu vektörler hücreler transfekte edilerek transkript düzeyi düşürüldü. İkincisinde hücreler ticari olarak sentez ettirilen siRNA ile transfekte edildi. Hax-1 transkript düzeyi düşürülen hücreler influenza virüsüleri ile enfekte edildi. Enfeksiyondan 8-12 saat sonra hücrelerden hazırlanan lizatlarda virüs miktarları Western melezleme tekniği ile karşılaştırıldı. Hax-1 proteini kodlayan bir plazmidin transfeksiyonu ile hücrelerdeki protein düzeyi arttırıldı ve bu artışın influenza virüs replikasyonuna etkileri araştırıldı. Diğer taraftan, konak hücrelerde Hax-1 protein düzeyindeki artış ya da azalışın, infuenza virüsü RNA polimeraz enzimine etkileri, bu virüs için geliştirilen minireplikon modelleri ile saptandı. Bulgular ve Sonuç: Hax1 transkript düzeyi düşürülen hücrlerde influenza virüs replikasyonunun beklenmedik bir şekilde baskılandığı saptandı. Aynı şekide Hax1 protein düzeyi arttırılan hücrelerde de influenza virüsü replikasyonunda yavaşlama görüldü. İnfluenza virüsü minireplikon modelleri ile yapılan testler de benzer sonuçlar veridi. HEK293 hücrelerinde Hax-1 proteinindeki artış viral RNA polimeraz aktivitelerini inhibe edici etki gösterdi. Elde edilen veriler Hax-1 proteininin her iki tip virüs replikasyonu üzerinde de negatif yönde etki ettiği sonucunu verdi. Anahtar Kelimeler: İnfluenza, Hax-1, PA, Viral RNA polimeraz, minireplikon Investigation of Influenza Virus Replication in Hax1 Gene Knock Down Cells 1. SUMMARY Aim: In this work, it was aimed to determine the effects of Hax1 protein on human type (A/WSN/H1N1) and avian type Influenza (A/Duck/Pan/H5N2) virus replication at the molecular level. For this purpose, Hax1 gene transcript levels in HEK293 and HeLa cells was suppressed by RNAi technology and the virus multiplication in these cells was investigated with Western hybridization and immunofluorescence techniques. Method: Two different methods were followed for reducing the Hax1 transcript levels in mammalian cells. First, the gene-specific siRNA-encoding plasmid vectors were generated and, transcript levels in the cells were reduced by transfection of these plasmids. The second, the cells were transfected with siRNA molecules synthesized commercially. Hax-1 gene knock down cells were infected with influenza viruses. 8 to 12 h post infection, the quantitiy of virus protein in lysates of infected cells was investigated with Western hybridization techniques. Hax-1 protein level in the cells was increased by transfection of plasmids encoding this proteins and the effects of this increase on influenza virus growth was also investigated. On the other hand, the effects of changes the amount of Hax1 protein in host cells on infuenza virus RNA polymerase enzyme were invastegated with minireplikon models developed for influenza viruses. Results and Conclusion: In was found that the influenza virus replication is unexpectedly suppressed in Hax1 gene knock down cells. The influenza virus growth was also negatively affected in the cells over-expressing Hax1 protein. The assays carried out with influenza virus minireplicons also gave the similar results. The over-expression of Hax1 protein in HEK293 showed inhibititory effects on viral RNA polymerase activity. From data obtained in this work, it was conclude that Hax1 proteins have negative regulatory effects on both human and avian types of influenza virus replication Anahtar Kelimeler: İnfluenza, Hax1, PA, Viral RNA polimeraz, minireplikon