Evaluation of wild type mastic tree (Pistacia lentiscus L.) germplam by molecular markers


Öğrenci: ALİMU ABUDULİ

Danışman: AHU ALTINKUT UNCUOĞLU

Özet:

YABANİ TİP SAKIZ AĞACI (PİSTACİA LENTİSCUS L.) GEN HAVUZUNUN  MOLEKÜLER MARKÖRLER İLE DEĞERLENDİ- RİLMESİ Sakız ağacı (Pistacia lentiscus L.) Akdeniz havzası kıyılarına yakın bölgelerde yaygın dağılım gösteren, yaprak dökmeyen, dioik bir çalıdır. Bu çalışmada dört farklı moleküler markörün (SSR, RAPD, ISSR ve ITS) kullanımıyla yabani tip 12 erkek ve 12 dişi sakız ağacı (P. lentiscus L.) germplazmı arasındaki ilişki ve genetik çeşitlilik, gelecekteki ıslah çalışmalarında ve germplazm koruma stratejilerinde etkin bir şekilde kullanılabilecektir. Bu dört çeşit markör kullanılarak, yabani tip sakız ağacı germplazmı farklı analizlerle incelendi. 24 sakız ağacı örneği 7 SSR, 50 RAPD, 50 ISSR ve ITS primerleri kullanılarak analiz edildi. Sonuç olarak; 40 SSR, 703 RAPD, 929 ISSR alleli ve ITS1 bölgesinden 260-292 baz çiftlik DNA dizi bilgisi elde edildi. 7 SSR, 50 RAPD ve 50 ISSR primerlerinden elde edilen alellerin ortalama sayısı sırasıyla; 5.7, 14 ve 18 olarak belirlendi. ITS1 bölgesine ait dizilerinin çoklu hizalamansı sonucunda 309 baz çifti elde edildi. Bu dört moleküler markörün verilerine ve genetik çeşitlilik parametrelerine göre maksimum ortalama majör allel frekansı SSR markörleri tarafından, minimum allel frekansı ise ISSR markörleri tarafından kaydedildi. Maksimum ortalama gen çeşitliliği ISSR markörlerinde, minimum ortalama gen çeşitliliği ise SSR markörlerinde gözlendi. Dört farklı moleküler markörün ortalama polimorfik bilgi içeriği (PIC) değerleri sırasıyla; 0.628 (7 SSR); 0.835 (50 RAPD); 0.887(50 ISSR) ve 0.837 (ITS) arasında değişmektedir, bu da ISSR markörlerinin diğer üç markör türüne göre daha bilgi verici olduğunu ortaya koydu. Bu çalışmada SSR, ISSR, RAPD, ITS markörlerinin tek tek ve birlikte incelenmesinden elde edilen sonuçlar, sakız ağacında bundan sonra gerçekleştirilecek genetik çeşitlilik ve filogenetik ilişkilerin değerlendirilmesine yönelik çalışmalara ışık tutacak niteliktedir. Dört farklı marköre dayalı populasyon yapısı analizleriyle 24 sakız ağacı genotipinin, SSR markörleriyle 7, RAPD markörleriyle 2, ISSR markörleriyle 5, birleştirilmiş dominant markörler (RAPD + ISSR) ile 3 ve ITS markörleri ile de 2 alt populasyona ayrıldığı görüldü. Bu dört farklı markör arasından SSR, RAPD ve ISSR markörlerinin sonuçları birbirine benzerdir, örneğin M9 (Alaçatı) ile M10 (Mesta Sakız Adası) ve F10 ile (Alaçatı) F11 (Seferihisar) aynı alt populasyondadır. Birleştirilmiş dominant markörlere dayalı populasyon yapısına ait analizlerinin ise, F10 (Mesta Sakız Adası) ile F11'i (Seferihisar) aynı alt populasyona, ancak M9 (Alaçatı) ile M10 (Mesta Sakız Adası) genotiplerini farklı alt populasyonlara ayırdığı görüldü. ITS markörüne dayalı populasyon yapısı analizi sonucuna göre de M9 (Alaçatı) ile F11 (Seferihisar) ve M10 ile F10 (Mesta Sakız Adası) genotipleri aynı alt populasyon grubunda yer almaktadır. SSR, RAPD, ISSR ve birleştirilmiş dominant markör datasına dayalı PCA sonucu grafiği, M9 (Alaçatı) ile M10’un (Mesta Sakız Adası) ve F10 (Mesta Sakız Adası) ile F11’in (Seferihisar) yakın ilişkili olduğunu göstermiştir. ITS markör datasına göre yapılan PCA sonucu ise, M9 (Alaçatı) ile M10’un (Mesta Sakız Adası) yakın ilişkili genotipler olduğunu ancak F10 (Mesta Sakız Adası) ile F11 (Seferihisar) genotiplerinin birbirine uzak ilişkili olduğunu göstermiştir. Dört farklı marköre dayalı filogenetik analiz, erkek ve dişi genotiplerin birbirlerinden farklı gruplara ayrıldığını gösterdi. SSR, RAPD, ISSR ve birleştirilmiş dominant markör verileri kullanılarak yapılan filogenetik NJ ağacı M9 (Alaçatı) ile M10 (Mesta Sakız Adası) ve F11 (Seferihisar) ile F10 (Mesta Sakız Adası) genotiplerinin yakın ilişkili olduğunu ve bunların aynı grupta yer ayrıldığını ortaya koydu. ITS markör datasına dayalı filogenetik NJ ağacı, M10 (Mesta Sakız Adası) ile M12 (Bornova/Gökdere) ve F10 (Mesta Sakız Adası) ile F2 (Karaabdullah) genotiplerinin birbirlerine yakın ilişkili olduğunu gösterdi. Ayrıca herbir moleküler markör için oluşturulan genetik uzaklık/coğrafi dağılım matrislerini ifade eden “Mantel Test” sonuçları arasında anlamlı bir ilişki olmadığı görüldü. Sonuç olarak, SSR, RAPD, ISSR ve ITS markörlerinin yabani tip sakız ağacında (P. lentiscus L.) filogenetik ilişkilerin ortaya konulmasında etkili olduğu görüldü. Ayrıca bu markörler ıslah programlarının geliştirilmesi, germplazmının korunması ve yabani tip sakız ağacı genetik kaynaklarının yönetimi için de kullanılabilir. ABSTRACT EVALUATION OF WILD TYPE MASTIC TREE (PISTACIA LENTISCUS L.) GERMPLAM BY MOLECULAR MARKERS Mastic tree (Pistacia lentiscus L.) an evergreen dioecious shrub, is widely distributed along the Mediterranean basin regions. In this study genetic diversity and relationship between wild type 12 male and 12 female mastic tree (P. lentiscus L.) germplasm by four different molecular marker (RAPD, ISSR, SSR, and ITS) techniques, can be used effectively for future breeding practices and germplasm conservation strategy, were used. All four marker systems distinguished the wild type mastic tree in various levels. The analyses were performed using 7 SSR, 50 RAPD, 50 ISSR and ITS primers on 24 mastic tree genotypes yielding 40 SSR, 703 RAPD, 929 ISSR alleles with 260-292 base pairs ITS1 region sequenced data. The average number of alleles produced from 7 SSR, 50 RAPD and 50 ISSR primers were 5.7, 14 and 18 respectively. The ITS1 multiple alignment result is 309 base pairs in length. According to the genetic diversity parameters based on these four molecular markers data we can see that maximum mean major allele frequency was recorded by SSR markers minimum was recorded by ISSR markers. Maximum mean gene diversity was observed from ISSR markers minimum was SSR markers. The mean polymorphic information content (PIC) values for four different molecular markers were ranged from (7 SSR) 0.628, (50 RAPD) 0.835, (50 ISSR) 0.887 and (ITS) 0.837 respectively suggested that ISSR marker is highly informative marker than other three marker types. This study demonstrated that SSR, ISSR, RAPD, ITS markers individually and in combination are efficient tools to study evaluate genetic diversity and phylogenetic relationship in mastic tree accessions in future studies. According to the population structure analysis of 24 mastic tree genotypes based on four different markers we can see that SSR markers divided our samples into 7 subpopulations RAPD, ISSR, combined dominant markers and ITS markers divided 24 mastic tree genotypes into 2, 5, 3 and 2 subpopulations respectively. Among these four different markers SSR, RAPD and ISSR markers result were similar to each other, M9 (Alaçatı) with M10 (Mesta Sakız Adası) and F10 (Mesta Sakız Adası) with F11 (Seferihisar) fell into same subpopulations. Population structure analysis based on dominant markers combination data indicated that F10 (Mesta Sakız Adası) and F11 (Seferihisar) fell into same subpopulation but M9 (Alaçatı) was separated with M10 (Mesta Sakız Adası) genotype. Population structure result based on ITS marker data indicated that M9 (Alaçatı), F11 (Seferihisar) and M10 with F10 (Mesta Sakız Adası) genotypes fell into same subpopulation group. The graphics of PCA result indicated that M9 (Alaçatı) with M10 (Mesta Sakız Adası) and F10 (Mesta Sakız Adası) with F11 (Seferihisar) genotypes were closely related genotypes based on SSR, RAPD, ISSR and combined dominant markers dada set. In the ITS marker based PCA result showed that M9 (Alaçatı) with M10 (Mesta Sakız Adası) were closely related but F10 (Mesta Sakız Adası) with F11 (Seferihisar) genotypes were very distant from each other. Phylogenetic relationship analysis indicated that male and female genotypes were mainly separated to each other into different clusters based on these four different markers. SSR, RAPD, ISSR, and combined dominant marker phygenetic NJ tree showed that M9 (Alaçatı) with M10 (Mesta Sakız Adası) and F10 (Mesta Sakız Adası) with F11 (Seferihisar) genotypes were closely related genotypes and they fell into same cluster. The results from the phylogenetic NJ tree based on ITS marker showed that closely related genotypes includes M12 (Bornova/Gökdere) with M10 (Mesta Sakız Adası) and F10 (Mesta Sakız Adası) with F2 (Karaabdullah) genotypes. It was also noted that there was no significant correlation between the genetic distance and geographic distance matrices (Mantel test) created by each molecular markers. In summary, SSR, RAPD, ISSR and ITS markers proved to be efficient tool in assessing phylogenetic relationships among wild type mastic tree (P. lentiscus L.) genotypes. Meanwhile they can be used for designing breeding programs, conservation of germplasm and management of wild type mastic tree genetic resources. September, 2015