Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Marmara Üniversitesi, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2007
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Mehmet Ali Akyüz
Danışman: SAFİYE ERDEM
Özet:MONOAMİN OKSİDAZ SUBSTRATLARININ ENZİMİN AKTİF BÖLGESİ İÇİNDE QM/MM YÖNTEMİ İLE MODELLENMESİ Son yıllarda MAO-A ve MAO-B enzimlerinin x-ışını yapılarının aydınlatılması, her iki enzimde de birbirine hemen hemen paralel ve 7.8 Å uzaklıkta konumlanmış iki aromatik tirozin grubu bulunduğunu göstermiştir; öyle ki, substrat olan amin katalizleme sırasında flavine yaklaşabilmek için bu iki aromatik halkanın arasından geçmek zorundadır. Flavine dayalı amin oksitleme işlevi yapan diğer enzimlerde de benzer yapıların bulunması, bu grupların önemli bir işleve sahip olabileceğini düşündürmektedir. Yakın zamanda, MAO-B Tyr435 mutant enzimleri üzerinde gerçekleştirilen kinetik ve kristal yapı çalışmaları, mutant enzimlerin aktivitesinde azalma göstermiştir. Bu azalma aromatik kafesin işlevinin, substratın nükleofilik karakterini arttırarak flavin koenzimine saldırısını güçlendirmek olduğu şeklinde yorumlanmıştır. Bu tez çalışmasında, aromatik kafes için önerilen işlevle ilgili daha detaylı bilgi sağlamak amacıyla, aşağıda tarif edildiği gibi 4 bölümden oluşan hesaplamalar gerçekleştirilmiştir: 1. İlk amaç, uygun bir aktif bölge model yapısı ve hesapsal yöntem tespit etmektir. Enzimin kristal yapısından başlayıp, flavini ve p-nitrobenzilamin substratının etrafını saran amino asitleri alıp, enzimin geri kalan kısmını silerek aktif bölge model yapısı oluşturuldu. Bu yapıdaki substrat QM/MM (kuantum mekanik/moleküler mekanik) ONIOM(HF/6-31G*: PM3: UFF) yöntemi ile optimize edildi. Elde edilen yapısal parametreler, p-nitrobenzilamin bağlı MAO-B kristal yapısı ile iyi bir uyum sağladı; böylece, kullanılan aktif bölge modelinin ve hesapsal yöntemin bu araştırma için uygun olduğu tespit edildi. 2. Aromatik kafesin işlevini araştırmak amacıyla benzilamin ve p-nitrobenzilamin substrat olarak seçilmiştir. Flavin N(5) atomu ile substratın a karbonu arasındaki mesafe art arda on değerde sabit tutularak her bir substratın geometrisi ONIOM(HF/6-31G*: PM3: UFF) yöntemi ile optimize edilmiştir. Daha sonra tüm yapının enerjisi tek nokta HF/6-31G* yöntemi ile hesaplanmıştır. Her iki substratın da aktif bölge içindeki en kararlı yerlerinin, aromatik kafesin merkezinde bulundukları konumlar olduğu gözlenmiştir. Bu sonuç, aromatik kafesin, gerekli konformasyon ve enerji değişikliklerini sağlayarak, kararlı bir enzim-substrat öncül kompleksi oluşmasına yardım ettiğini göstermektedir. Substratların aromatik kafesin içinden geçerek flavine ilerlemeleri esnasında, yapılarında ve elektronik özelliklerinde oluşan değişiklikler incelenmiştir. Elde edilen bulgular, substratın amin azotunun negatif yükünün, substrat serbest halde veya aromatik kafesin dışındayken sahip olduğu yükten daha fazla olduğunu göstermiştir. 3. ONIOM(HF/6-31G*: PM3: UFF) yönteminin amin azotu üzerindeki yük artışını tespit edebilmede ne kadar hassas olduğunu kontrol etmek amacıyla, küçük model sistemler (benzen-amonyak ve model aromatik kafes-amonyak) üzerine çeşitli yüksek seviye hesaplamalar yapılarak incelenmiştir. Bu hesaplamalardan, aromatik halkalar arasına yerleştirilen bir aminin nükleofilik karakterinin artmasına, aromatik p–elektronları ile amin hidrojeni arasındaki H-bağı etkileşimlerinin sebep olduğu anlaşılmıştır. 4. İkinci bölümde tarif edilen hesaplamalar MAO-B Tyr435 mutant enzimleri (Tyr435Phe, Tyr435His, Tyr435Leu veTyr435Trp)için tekrarlanmıştır. Substrat aromatik kafesin merkezinde iken, mutant enzimlerdeki amin azotunun negatif yükünün doğal enzimdekinden daha düşük olduğu hesaplanmıştır. Bu konumdaki dört mutant enzim için, azot yükünde hesaplanan azalma, deneysel verileri mevcut olan katalitik etkinlik değerleri, D(DG#), ile çok iyi bir doğrusal ilişki (R2 = 0.81) vermiştir. Bu sonuç ve bu tezde elde edilen diğer elektronik özellikler, aromatik kafes için önerilen rolü doğrulamakta ve MAO enziminin kataliz mekanizması ile ilişki göstermektedir. SUMMARY MODELING OF THE MONOAMINE OXIDASE SUBSTRATES IN THE ENZYME ACTIVE SITE BY QM/MM METHOD Recent elucidation of the x-ray structures of MAO-A and MAO-B showed that in both enzymes, two aromatic tyrosyl residues are situated 7.8 Å apart in an approximately parallel configuration such that the amine substrate must pass between the two aromatic tyrosyl rings to reach the flavin for catalysis. This type of structure is also observed in other flavin-dependent amine oxidizing enzymes and appears to have functional significance. Recent kinetic and crystallographic studies on Tyr435 mutants of MAO-B showed a decrease in the activity of mutant enzymes, which suggests that functional role of this aromatic cage is to activate the amine substrate by enhancing its nucleophilicity for attack on the flavin coenzyme. In this thesis, to provide further insights into the proposed roles suggested for the aromatic cage, we performed computational studies in 4 parts as described below: 1. The first aim is to find the suitable active site model and the computational method. The model of the enzyme active site was built by starting from the enzyme crystal structure, including flavin and the aminoacid residues surrounding the p-nitrobenzylamine substrate and deleting rest of the enzyme. The substrate in the active site model was then optimized by using QM/MM-ONIOM(HF/6-31G*: PM3: UFF) method. Structural parameters obtained were in good agreement with the available crystal structure of p-nitrobenzylamine bound to MAO-B, suggesting that the model and the method used were suitable for this type of investigation 2. In order to investigate the function of the aromatic cage, benzylamine and p-nitrobenzylamine were selected as substrates. The geometry of each substrate was optimized at ten successive distances constrained between the substrate aC and the flavin N(5) by using ONIOM(HF/6-31G*: PM3: UFF) method. Energy of the overall system was further minimized by single point HF/6-31G*. The most stable position of each substrate at the active site corresponds to the center of the aromatic cage. This implies that aromatic cage facilitates the formation of a stable pre-reactive enzyme-substrate complex providing the necessary energetic and conformational changes. Alterations in the structural and electronic properties of the substrates were investigated as they pass through the aromatic cage toward the flavin. Results showed that the negative charge on the substrate’s amine nitrogen was larger along the path in the aromatic cage relative to the charge on the free substrate and outside the aromatic cage. 3. Small model systems, benzene-ammonia complex and model aromatic cage-ammonia complex, were investigated in detail with various high level calculations to test the accuracy of ONIOM(HF/6-31G*: PM3: UFF) method in predicting the increase in electronic charge of amino nitrogen. Calculations showed that the increase in nucleophilicity of the amine placed between the aromatic rings is due to the H-bonding interactions between the amine hydrogen and the aromatic p–electrons. 4. The same procedure described in part 2 was repeated for the MAO-B Tyr435 mutants (Tyr435Phe, Tyr435His, Tyr435Leu, and Tyr435Trp). The negative charge on amino nitrogen in the mutant enzymes was calculated to be smaller than the charge in the wild type enzyme when the substrate is located at the center of the aromatic cage. At this location, calculated decrease in the nitrogen charge showed a very good linear correlation (R2 = 0.81) with the experimentally available catalytic efficiency, D(DG#), for four mutant enzymes. This result and other electronic features obtained in this thesis support the proposed role of the aromatic cage and have relevance to the MAO catalytic mechanism.