Halofilik mikroorganizmalara ait lipaz enzimlerinin Escherichia coli'de üretilmesi ve analizi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Marmara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2017
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: ABDOULIE O. TOURAY
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): Ayşe Ogan
Eş Danışman: Kadir Turan
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Lipazlar (triaçilgliserol hidrolazlar E.C. 3.1.1.3), hidrolazlar enzim ailesi içerisinde yer alan, gliserol ve yağ asiti zincirlerinin oluşturduğu esterlerin hidrolizini katalizleyen enzimlerdir. Lipazlar ökaryotik ve prokaryotik yapıda tüm canlılarda yaygın olarak bulunurlar. Özellikle mirobiyal organizmalarda sentezlenen lipazlar, pH, sıcaklık, tuz konsantrasyon gibi ortam koşullarındaki değişmelere karşı daha toleranslı olmaları ve substrat spsesifikliklerinin yüksek olması nedeniyle, endüstriyel açıdan büyük önem taşımaktadır. Bu enzimlerin bir kısmı, gıda, deterjan, ilaç ve çeşitli kimyasal maddelerin üretilmesinde endüstride yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu bakımdan var olan lipaz enzimlerini daha etkin hale getirmek, daha düşük maliyetlerle üretmek, endüstriyel kullanım kapasitesi yüksek yeni lipaz enzimleri keşfetmek amacıyla, rekombinant DNA teknolojilerini de kullanarak yoğun bilimsel çalışmalar yapılmaktadır. Bu tez çalışmasında da ılımlı halofilik bakteriler olan Bacillus safensis ve Bacillus licheniformis ile aşırı halofilik arkebakter olan Haloarcula hispanica'ya ait hipotetik olarak tanımlanmış lipaz genleri, daha düşük maliyette enzim üretmek amacıyla Escherichia coli hücrelerine aktarıldı. Escherichia coli hücrelerinde sentez edilen halofilik bakteri lipaz enzimleri kalitatif ve kantitatif olarak analiz edildi. Çalışmada mikroorganizma olarak B. safensis, B. licheniformis, H. hispanica ve E. coli'nin farklı suşları kullanıldı. Halofilik bakteri genleri, bu bakterilerden izole edilen genom DNA'sı üzerinden, spesifik oligonukleotid primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyon (PZR) ile çoğaltıldı. Çoğaltılan lipaz genleri, standart DNA teknikleri ile E. coli hücrelerinde ekspresyon yapan plazmit vektörler klonlandı. Vektörlere klonlanan lipaz genleri DNA dizi analizleri ile kontrol edildi. Lipaz ekspresyon vektörleri E. coli hücrelerine transforme edildi ve bu hücrelerde lipaz enzimi sentezi SDS-PAGE teknikleri ile analiz edildi. Lipaz geni aktarılan E. coli hücrelerinde, lipaz enzim aktiviteleri pNFL, pNFP ve pNFA sentetik substratlar kullanılarak spektrofotometrik yöntemle belirlendi. DNA dizi analizleri sonuçları oluşturulan pazmit vektörlerinin tasarlanan yapılar ile birbiri uyumlu olduğunu gösterdi. Transformant E. coli lizatlarının SDS-PAGE analizleri halofilik organizma lipaz enzimlerinin farklı miktarlarda da olsa sentezlendiğini ortaya koydu. Sentetik p-nitrofenil laurat ve p-nitrofenil palmıitat substratları kullanılarak yapılan aktivite testlerinde, B. licheniformis'e ait hipotetik lipaz geni üzerinde sentez edilen enzimin en yüksek aktiviteye sahip olduğu görüldü. Aşırı halofilik H. hispanica lipaz enziminin E. coli hücrelerinde yeteri kadar sentez edilmediği ve istenilen düzeyde aktif olmadığı saptandı. P-nitrofenil asetat ile yapılan aktivite testlerinde ise, büyük olasılıkla endojen esteraz enzimlerinin reaksiyonu etkilemeleri nedeniyle ayırt edici sonuç alınamadı. Ilımlı halofilik özellik taşıyan B. licheniformis'e ait lipaz enziminin NaCl ve Triton X-100 konsantrasyonlarındaki artışa daha yüksek tolerans gösterdiği ortaya konuldu. Bu özellikler, B. licheniformis lipaz enziminin, endüstriyel kullanım potansiyeline sahip oluğunu göstermektedir. Dolayısıyla B. lichenifomis hipotetik lipaz geni tarafından kodlanan bu enzimin saflaştırılması ve daha ileri düzeylerde işlevsel analizlerin gerçekleştirilmesi ileriye yönelik önemli bir hedef olarak görünmektedir.