Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Marmara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2003
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: TUĞÇE DAŞTAN
Danışman: Kadir Turan
Özet:: KİTOZAN MİKROKÜRELERDEN DNA SERBESTLEŞMESİNİN İN VİTRO KOŞULLARDA İNCELENMESİ Son yıllarda katyonik özelliği nedeniyle kitozan, viral olmayan yolla hücrelere gen transferi aracı olarak büyük ilgi uyandırmıştır. Bununla birlikte kitozan mikrokürelerle hücrelere gen transferi etkinliği oldukça düşük düzeydedir. Diğer taraftan memeli hücrelerine gen transferi için yeni viral olmayan araçların geliştirilmesi yönünde yoğun çaba sarf edilmektedir. Bu bağlamda, çalışmamızda farklı koşullarda hazırlanan kitozan mikrokürelerin DNA tutma kapasiteleri ve DNA tutma etkinlikleri ve mikrokürelerden DNA serbestleşme özellikleri incelendi. DNA/kitozan mikrokürelerin hazırlanmasında üç farklı boyutta plazmid DNA'sı ve salmon sperm DNA kullanıldı. Plazmid DNA'lar Escherichia coli DH5a konak bakterisinde çoğaltıldı ve alkali SDS-liziz metodu ile izole edildi. DNA/kitozan mikroküreler koaservasyon yöntemi ile hazırlandı. Mikrokürelerden DNA serbestleşmesini belirlemek için mikroküreler 5 mg/ml final konsantrasyonda FTS içerisinde süspanse edildi ve 37 ºC'da karışmaya bırakıldı. Mikrokürelerden serbestleşen DNA spektrofotometrik olarak ölçüldü. Mikrokürelerin DNA tutma etkinlikleri, kullanılan kitozan konsantrasyonuna bağlı olarak artış gösterdi. Buna karşın, bu mikrokürelerin DNA tutma kapasitesinde düşme saptandı. Kullanılan DNA moleküllerinin konformasyonu da mikrokürelerin DNA tutma etkinlikleri üzerinde etkili oldu. Doğrusal ve kırılmış SS-DNA'lar ile hazırlanan mikrokürelerin DNA tutma etkinlikleri halkasal plazmid DNA'lar ile hazırlanan örneklere göre daha yüksek bulundu. Mikrokürelerden serbestleşen DNA miktar ve oranları kullanılan kitozan konsantrasyonuna bağlı olarak azalma gösterirken, DNA miktarına bağlı olarak artış gösterdi. Küçük molekül ağırlıklı plazmid DNA molekülleri, büyük molekül ağırlıklı plazmidlere ve doğrusal salmon sperm DNA'ya göre daha hızlı serbestleşti. Glutaraldehit ile güçlendirilen mikroküreler yıkılmaya karşı daha dirençli bulundu. Elektroforetik analizler kitozan mikrokürelerde tutulan DNA moleküllerinin yıkılmadan korunduğunu gösterdi. SUMMARY: THE INVESTIGATION OF DNA RELEASE FROM CHITOSAN MICROSPHERES IN VITRO CONDITIONS Recently, chitosan as a non-viral vehicle for transferring of DNA molecules into the cells attracts much attention because of its cationic properties. However, the transfection efficiency of chitosan microspheres is quite low. On the other hand, extensive efforts are being expended for improving new non-viral vehicles for gene transfer into the mammalian cells. In this respect, we have investigated DNA loading efficiency and loading capacity of chitosan microspheres prepared in different conditions and release profiles of DNA. Three different sizes of plasmid DNA and salmon sperm DNA were used for preparation of DNA/chitosan microspheres. Plasmid DNAs were amplified in Escherichia coli DH5a and isolated by alkali SDS-lysis method. DNA/Chitosan microspheres were prepared by coacervation method. For assaying the release of DNA, DNA/chitosan microspheres were suspended in PBS at 5 mg/ml final concentration and shaken at 37 ºC. The release of DNA from microspheres was spectrophotometrically assayed. DNA loading efficiency of microspheres increased depending on the concentration of chitosan. In contrast, DNA loading capacity of these microspheres decreased. DNA conformation also affected the encapsulation efficiency of microspheres. Loading efficiency of shared-linear salmon sperm DNA was found higher than that of circular plasmid DNAs. The rate and amount of released DNA from microspheres decreased depending on the concentration of chitosan, in spite of increase depending on quantity of DNA. Circular plasmid DNA with low molecular weight released faster than high molecular weight plasmids and linear salmon sperm DNA. The microspheres cross-linked with glutaraldehyde were found to be more resistant to degradation. Electrophoretic analysis showed that DNA molecules entrapped in chitosan particles remained intact.