6-hidroksi dopamin ile parkinson oluşturulmuş sıçan beyinlerinden aromatik-L-Amino Asid dekarboksilaz enziminin izolasyonu ve enziminin iki boyutlu elektroforesz ile incelenmesi


Thesis Type: Doctorate

Institution Of The Thesis: Marmara Üniversitesi, Turkey

Approval Date: 2002

Thesis Language: Turkish

Student: Aslıhan Günel

Consultant: AYŞE OGAN

Abstract:

Bu çalışmada 6-OHDA ile Parkinson oluşturulmuş sıçan beyinlerinden aromatik-L-amino asid dekarboksilaz (EC 4.1.1.28) enzimi izole edildi ve saflaştırıldı. Kontrol grubu sıçan beyinleri ile Parkinsonlu sıçan beyinlerinden izole edilen enzimin kinetik aktivite değişimleri karşılaştırıldı. Hastalıklı ve sağlıklı sıçan beyin homojenatlarının iki boyutlu jel elektroforezinde gösterdikleri protein spotları değerlendirildi. Sıçan beyinlerine 6-hidroksidopamin enjekte edilerek sıçanlarda Parkinson modelinin oluşturulması amaçlandı. Çalışmada kullanılan üç sıçandan ikisinde Parkinson modeli başarı ile gerçekleştirildi. Lowry metodu ile yapılan protein konsantrasyon tayinlerinde, ham beyin ekstraktlarındaki protein konsantrasyonları kontrol grubunda 330 mg/dL ve Parkinsonlu grupta 420 mg/dL olarak bulundu. Hastalıklı ve sağlıklı sıçan beyinlerinden izole edilen aromatik-L-amino asid dekarboksilaz enzimi DEAE-Sephacel iyon değişim kromatografisi ile kısmen saflaştırıldı. DEAE-Sephacel iyon değişim kromatografisinde elde edilen fraksiyonlar kullanılarak yapılan kinetik aktivite analizlerinde Parkinsonlu grup için KM 3.3x10-4 M, kcat 0.083 s-1ve kontrol grubu için KM 7.2x10-4 M, kcat 0.44 s-1 olarak bulundu. Ham beyin homojenatlarının hem doğal şartlarda hem de denature şartlarda gerçekleştirilen poliakrilamid jel elektroforezi sonuçları hem kontrol grubunda hem de hastalıklı grupta aynı bantları vermektedir. Hem kontrol grubu beyin homojenatlarının hem de Parkinson grubu beyin homojenatlarının iki boyutlu jel elektroforez sonuçlarına bakıldığında hastalıklı ve sağlıklı koşullarda önemli ölçüde farklılıklar olduğu görüldü. Kontrol grubunda var olan 13 spot hastalıklı grupta tamamen kaybolurken, hastalıklı grupta iki yeni protein spotu oluştu. Bazı protein spotlarının yoğunlukları Parkinsonlu grupta önemli ölçüde azalırken, bir protein spotunun yoğunluğu Parkinsonlu grupta önemli ölçüde arttı. Bu çalışmanın sonuçları proteom analizlerinin kalbi olan iki boyutlu jel elektroforezi tekniğinin gücünü kanıtlamaktadır. Günümüzde sadece proteom analizi hastalıklarla ilgili proteinlerin tanımlanmasına olanak vermektedir. ABSTRACT ISOLATION OF THE AROMATIC-L-AMINO ACID DECARBOXYLASE (EC 4.1.1.28) FROM THE BRAINS OF THE RATS HAVING 6-HYDROXY DOPAMINE INDUCED PARKINSON DISEASE AND INVESTIGATION OF THE ENZYME BY TWO-DIMENSIONAL ELECTROPHORESIS The aim of this study was to isolate and purify aromatic-L-amino acid decarboxylase (EC 4.1.1.28) enzyme from Parkinson Disease induced and the healthy control group rat brains and compare the alterations in the kinetic activities of the isolated enzyme. The protein spots displaying on the 2-DE patterns of the diseased and the healthy control group crude rat brain homogenates were evaluated. Parkinson disease was induced by injecting 6-hydroxydopamine into the brains of the rats. Parkinson model formation was successful in two rats out of three. The protein concentrations of the control and the Parkinson induced group crude brain extracts by Lowry method were found to be 330mg/dL and 420 mg/dL respectively. Aromatic-L-amino acid decarboxylase was isolated from the brains of the diseased and healthy control rats. The enzyme was partially purified by DEAE-Sephacel ion exchange chromatography. The kinetic activity of the enzyme calculated after the purification step for the diseased group was KM 3.3x10-4 M, kcat 0.083 s-1and for the control group was KM 7.2x10-4 M, kcat 0.44 s-1 respectively. Both the polyacrylamide gel electrophoresis of the crude brain homogenates under the native and denaturating conditions displayed matching bands for both of the groups. 2-DE patterns of the diseased and the control group showed considerable differences. 13 spots displaying in the control group completely disappeared in the diseased group while 2 spots displaying in the diseased group were absent in the control group. The intensities of some of the protein spots diminished drastically in the Parkinson induced group but the intensity of a single protein spot appearing in the control group increased considerably in the Parkinson group. The results of this study confirm the power of 2D-PAGE technique of the proteom analysis. Currently only the proteom analysis enables the identification of disease correlated proteins.