Dekarboksilaz aktivitesine sahip poliklonal antikor elde edilmesi


Thesis Type: Doctorate

Institution Of The Thesis: Marmara Üniversitesi, Turkey

Approval Date: 2002

Thesis Language: Turkish

Student: Özlem Gencer Önder

Consultant: AYŞE OGAN

Abstract:

Bu çalışmada tavşanlarda dekarboksilaz aktivitesine sahip poliklonal katalitik antikorlar, abzimler, N-(3-Karboksipropil)-4-Siklopentilmetilpiridin haptenine karşı üretilmiştir. Seçilen hapten, N-(3-Karboksipropil)-4-Siklopentilmetilpiridin yeni bir yöntemle sentezlenerek, taşıyıcı protein olarak tiroglobulin'e konjuge edilmiştir. Hazırlanan hapten-protein konjugatı kullanılarak, iki adet yetişkin albino cinsi erkek tavşan immünize edilmiştir. Bu hayvanlardan alınan serumdan Protein G-Agaroz kolon kromatografisi metodu ile IgG'ler saf olarak Tavşan l ve Tavşan 2 için sırasıyla % 7.19 ve % 7.87 verimle elde edilmiştir. Yapılan Davis-PAGE analizinde gözlenen tek bant; SDS-PAGE ve Western Blot analizlerinde gözlenen iki bant, IgG'lerin saflığını kalitatif olarak doğrulamıştır. Ayrıca IgG'lerin oluşumu immünodifüzyon ve immünoelektroforez metodları ile takip edilmiş ve gözlenen tek bir presipitin çizgisi, spesifik saf bir poliklonal karışım oluştuğunu kanıtlamıştır. Hazırlanan abzimlerin haptene spesifikliğinin kantitatif tayini direkt ELISA metodu ile yapılmış ve KD değerleri sırasıyla Tavşan l ve Tavşan 2 için 7.8x10-8 M ve 8.2x10-8 M bulunmuştur. Abzimin, DOPA'dan dopamin oluşum reaksiyonu katalizinin, kinetik analiz sonuçları Tavşan 1 için KM=3.85x10-4 mM, kkat=0,293 s-1, ve Tavşan 2 için KM=3.74 x 10-4 mM, kkat=0.295 s-1 olarak hesaplanmıştır. Hesaplanan kkat/kunkat değerleri sırasıyla Tavşan 1'de 1.64 ve Tavşan 2'de 1.63 olarak bulunmuştur. Reaksiyon hızı düşük olmasına rağmen abzimin DOPA'dan dopamin oluşum reaksiyonunu katalizlediği gösterilmiştir. Düşük reaksiyon hızı beklenen bir sonuçtur zira literatürde şimdiye kadar abzim aktivitelerinin nadiren enzim aktivitelerine yaklaşabildikleri kaydedilmiştir. Ekim, 2002 Özlem GENCER ÖNDER ABSTRACT PRODUCTION OF POLYCLONAL CATALYTIC ANTIBODIES DISPLAYING DECARBOXLASE ACTIVITY In this study, polyclonal catalytic antibodies, abzymes, displaying decarboxylase activity were raised against N-(3-Carboxypropyl)-4-Cyclopentylmethylpyridine hapten in rabbits. Selected hapten, N-(3-Carboxypropyl)-4-Cyclopentylmethylpyridine, synthesized by a new method, was conjugated to tyroglobulin. Two mature albino rabbits were immunized against this hapten-protein conjugate. The purification of the serums of the rabbits 1 and 2 by protein G-agarose column chromatography yielded 7.19 % and 7.87 % immunoglobulin G (IgG), respectively. The single band in Davis-PAGE analysis and two bands in SDS-PAGE and Western Blot analyses qualitatively confirmed the purity of the IgGs. Furthermore; the production of the IgGs were followed-up by immunodiffusion and immunoelectrophoretic methods. The single precipitation band proved the purity of a single specific polyclonal mixture produced. The specificity of the prepared abzymes were quantitatively assayed by direct ELISA method and KD values of 7.8x10-8 M and 8.2x10-8 M were determined for the Rabbits 1 and 2, respectively. From the kinetic analysis data of the catalysis of the reaction of dopamine formation from DOPA by the abzyme, the values of KM=3.85x10-4 mM, kcat=0,293 s-1 and KM=3.74 x 10-4 mM, kcat=0.295 s-1 were calculated for Rabbits 1 and 2, respectively. The respective kcat/kuncat values of 164 and 163 were calculated for Rabbits 1 and 2. Although the reaction rate displayed by the abzyme is low, it catalyzes the reaction of dopamine formation from DOPA. The low reaction rate was an expected result since to date, in literature the reaction rates of the abzymes seldom are comparable to the enzymes. October, 2002 Özlem GENCER ÖNDER