Genetik absans epilepsi (GAERS) deneysel modelinde hipokampüs proteomlarının profillendirilmesi


Thesis Type: Doctorate

Institution Of The Thesis: Marmara Üniversitesi, Turkey

Approval Date: 2007

Thesis Language: Turkish

Student: Serap Demir

Consultant: AYŞE OGAN

Abstract:

Beyindeki nöronların anormal aktivasyonu sonucu oluşan kronik ve tekrarlayan nöbetlerle giden bir bozukluk olan epilepsi en sık karşılaşılan nörolojik tablolardan biridir. Yapılan epilepsi çalışmalarında, bazı epilepsi türlerinde Na+, K+, Ca++ gibi iyon kanallarında veya nöronal sinyal iletiminden sorumlu genlerde farklılıklar saptanmakla birlikte epilepsinin moleküler, biyokimyasal ve farmakolojik temelleri tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu çalışmanın amacı; Strasbourg-Genetik Absans Epilepsi (GAERS) deneysel modelinde protein değişikliklerini Proteomik teknolojisi ile saptamak ve karşılaştırmaktır.Elektroforez ve kütle spektrometresinin kombinasyonu olan proteomik evrensel bir tekniktir. Çözünür proteinler ilk olarak iki boyutlu elektroforezde pI ve moleküler büyüklüklerine göre ayrılırlar. Daha sonra jelden kesilen proteinler triptik parçalanmayı takiben peptit kütle parmak izinden tanımlanırlar. Çalışmamızda kontrol (n=5) ve GAERS (n=5) hipokampüs proteinleri çözünürleştirilerek iki boyutlu jel elektroforezi (2D-PAGE) ile ayrıldı ve protein spotları kolloidal Coomassie boyası ile boyanarak görünür hale getirildi.PDQuest v.8.0.1 software programı ile her 2DE jelinde yaklaşık 1800 protein spotu sayıldı. 15 bağımsız deneyle elde edilen GAERS ve kontrol hipokampüs grubuna ait 2DE jellerindeki protein spotları PDQuest ile karşılaştırıldı. Kontrolde görülen SSP 7236 ve SSP 6432 numaralı iki protein spotu (sırasıyla pI 7.6, MA 13 kDa ve pI 7, MA 40 kDa) GAERS grubunda tamamen kayboldu. GAERS grubundaki SSP 8315 ve SSP 3311 numaralı diğer iki protein spotu (sırasıyla pI 9, MA 36 kDa and pI 6, MA 18 kDa) kontrolde yoktu. Bu dört farklı protein spotu matriks-destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon zaman uçuşlu kütle spektrometresi (MALDI-Tof) ile analiz edildi. Dört protein spotu sırasıyla hemoglobin alt ünitesi beta-1, mitokondrial 39S ribosomal protein L39, siklin katlanmış protein 1, nöron-spesifik protein aile üyesi 1 protein olarak tanımlandı. Proteomik analizlerle elde edilen bu bilgiler epilepsi patojenezini anlamada yararlı olabilir. ABSTRACT THE PROFILE OF THE HIPPOCAMPUS PROTEOMES IN THE GENETIC ABSENCE EPILEPSY (GAERS) EXPERIMENTAL MODEL Epilepsy, a chronic disorder characterized by repeated seizures resulting from abnormal activation of neurons in the brain, is one of the most frequent neurological disorders. Although studies defined mutations and polymorphisms in the genes related to Na+, K+, Ca++ channels and neuronal signaling in some types of epilepsy but, molecular , biochemical and pharmacological basis of epilepsy is still poorly understood. The aim of this study is to detect and compare the protein changes in Genetic Absence Epilepsy Rats from Strasbourg (GAERS) Experimental Model with proteomics technology.Proteomics technique which is based on a combination of electrophoresis and mass spectrometry is a universal technique in which solubilized proteins are first separated by two-dimensional electrophoresis on the basis of their pI’s and molecular sizes and then identified by peptide mass fingerprinting following excision from the gel and tryptic digestion.In this study proteins solubilized from hippocampus extracts of controls (n=5) and GAERS (n=5) were separated by two dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) and the protein spots were visualized following stain with colloidal Coomassie blue. Approximately 1800 protein spots were counted in each 2D-PAGE gel using the PDQuest v.8.0.1 software. GAERS and control hippocampus protein spots appearing in 2D-PAGE gels were compared in 15 independent experiments with PDQuest. Two protein spots, SSP 7236 and SSP 6432 displayed in the controls (pI 7.6, MW 13 kDa and pI 7, MW 40 kDa respectively) completely disappeared in the GAERS group. Other two spots, SSP 8315 and SSP 3311 (pI 9, MW 36 kDa and pI 6, MW 18 kDa respectively) present in GAERS group, were absent in the controls. These four different proteins were analyzed by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-Tof). They were identified as hemoglobin subunit beta-1, mitochondrial 39S ribosomal protein L39, cyclin fold protein 1, neuron-specific protein family member 1, respectively.The information obtained from the proteomic analysis may be useful in understanding the pathogenesis of epilepsy.