Transcriptional changes in Escherichia coli upon treatment with (-)-roemerine


Thesis Type: Postgraduate

Institution Of The Thesis: Marmara University, Institute for Graduate Studies in Pure and Applied Sciences, Department of Bioengineering (Eng), Turkey

Approval Date: 2016

Thesis Language: English

Student: DİLARA AYYILDIZ

Co-Consultant: BÜLENT MERTOĞLU

Consultant: Berna Sarıyar Akbulut

Abstract:

Tez Başlığı: (-)-Roemerin muamelesi altındaki Escherichia coli’de transkripsiyonel değişimler 1928’de Fleming tarafından ilk antibiyotik olan Penisilin’in keşfedilmesinden sonra, bakteriyel direnç mekanizmalarındaki hızlı artış sebebiyle yeni etki mekanizmalarına sahip antibakteriyellerin geliştirilmesi önemli bir süreç haline gelmiştir. Bu bağlamda, yeni antibakteriyel ajanların araştırılmasında doğal kaynak olan bitkiler dikkatleri üzerlerine çekmektedir. Bu doğrultuda, mevcut çalışmada, bitki kökenli bir alkaloit olan (-)-roemerin’in Escherichia coli TB1 hücreleri üzerindeki antibakteriyel etkisi transkriptom düzeyinde incelenmiştir. E. coli TB1 hücrelerindeki transkripsiyonel değişimler, 1 saat boyunca 1xMİK (Minimum inhibitör Konsantrasyonu) (100 mg/ml) (- )-roemerin’e maruz bırakıldıktan sonra incelenmiştir. Karşılaştırma amacı ile ilaç ile muameleden hemen sonra (0. dakikada) ve muameleden bir saat sonra (60. dakikada) alınan ilaçlı (R0 ve R60) ve kontrol (D0 ve D60) hücre örneklerinden elde edilen toplam RNA kullanılmıştır. İzole edilen RNA örnekleri hem mikroarray için hem de kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile validasyon için kullanılmıştır. 60 dakikalık ilaç muamelesi sonrasında bakterinin tepkisi transkiptom seviyesinde önemli değişiklikler olduğunu göstermiştir. İlacın etkisinin net olarak görüldüğü D60-R60 grubunda 213 gende (p değeri<0.05) bu değişimler gözlenmiştir. Protein kodlayan gen setlerinin işlevsel zenginleştirme analizleri Clusters of Orthologous Groups (COGs) veritabanı, The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) biyoinformatik aracı ve zenginleştirme sonuçlarını moleküler yolaklar ve Gen Ontoloji (GO) terimleri olarak gösteren AmiGO 2 kullanılarak yapılmıştır. Hücrelerin (- )-roemerin’e karşı verdiği ilk an tepkisi olarak çoklu antibiyotik direnç genlerindeki artış gözlemlenmiştir. Bir saatlik muamelenin ardından ise, dış hücre zarı proteinlerindeki değişikliklere bağlı olarak karbonhidrat taşınımı ve enerji metabolizmasındaki azalmanın hücrelerde besin kıtlığına yol açtığı bulunmuştur. (-)- Roemerine muamelesi altında meydana gelen değişikliklerin çoğunluğunun ise flagella sentezinin durdurulması ve biyofilm oluşumundaki eksiklikler olarak bulunmuş ancak bunların hücrelerin kendilerini (-)-roemerin alkaloidine karşı korumasında yetersiz kaldığı tahmin edilmiştir. ABSTRACT Thesis Title: Transcriptional Changes in Escherichia coli Upon Treatment with (-)- Roemerine The development of antibacterials with novel action mechanisms has become a challenging task due to the rapid increase in the bacterial resistance mechanisms since the introduction of the first antibiotic, penicillin, by Fleming in 1928. In this sense,plants have drawn attention as natural sources in the search for new antibacterials. Thus, in the current study, the antibacterial mechanism of the plant derived alkaloid (-)- roemerine against Escherichia coli TB1 cells were investigated on a transcriptomic level. Transcriptional changes in E. coli TB1 cells were investigated upon one hour treatment with 1xMIC (minimum inhibitory concentration) (100 mg/ml) (-)-roemerine. Total RNA extracts of cell samples taken just after treatment (0 min) and one hour after treatment (60 min) from drug treated (defined as R0 and R60) and control cells (defined as D0 and D60) were comparatively analyzed. The RNA samples were used for both microarray analysis and quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction validation. The response to treatment after 60 min pointed out significant alterations on the transcriptome level. 213 of the altered genes (p-value<0.05) were found in the D60-R60 group, which explicitly represent the effect of treatment after 60 minutes. The functional enrichment analyses of the protein encoding gene sets were achieved through Clusters of Orthologous Groups (COGs) database, The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) bioinformatics tool and AmiGO 2, which present the enrichment results for molecular pathways and Gene Ontology (GO) terms. The topological analysis of the networks was performed via CytoHubba plugin of Cytoscape software. Clustering of functionally related genes via COGs database and DAVID enrichment tool pointed out significantly altered biological processes and molecular pathways. As an instant response to (-)-roemerine the multiple antibiotic resistance genes were up-regulated. Following one-hour treatment with (-)-roemerine, it was clear that the alterations in outer membrane proteins resulted in a decrease in the rate of carbohydrate transport and energy metabolisms leading to nutrient limitation. The majority of the alterations upon (-)-roemerine treatment resulted in the deficiency in flagellar motility and loss of ability for biofilm formation leading to insufficient protection.